Fondation de teinture Ziehl-Neelsen, réactifs et technique

Le Ziehl-Neelsen tache dans une technique de coloration pour identifier les micro-organismes résistants aux alcools (AAR). Le nom de cette procédure de microbiologie fait référence à ses auteurs: le bactériologiste Franz Ziehl et le pathologiste Friedrich Neelsen.

Cette technique est un type de coloration différentielle qui implique l'utilisation de différents colorants afin de créer un contraste entre les structures que vous souhaitez observer, différencier et identifier plus tard. La coloration de Ziehl-Neelsen sert à identifier certains types de microorganismes.

Certains de ces microorganismes sont des mycobactéries (par exemple,Mycobacterium tuberculosis), nocardias (par exemple,Nocardia sp.) et certains parasites unicellulaires (par exemple,Cryptosporidium parvum). Beaucoup de bactéries peuvent être classées par une technique commune appelée coloration de Gram.

Cependant, certains groupes bactériens ont besoin d'autres méthodes pour les identifier. Des techniques telles que la coloration de Ziehl-Neelsen nécessitent des combinaisons de colorants avec la chaleur pour fixer la première à la paroi cellulaire.

Vient ensuite un processus de décoloration qui permet deux résultats: la résistance ou la sensibilité à la décoloration par les acides et les alcools.

Index

• 1 fondation
  • 1.1 Coloration secondaire
• 2 réactifs
  • 2.1 Coloration primaire
  • 2.2 Solution décolorante
  • 2.3 Colorant secondaire (anti-colorant)
• 3 technique
  • 3.1 Procédure de coloration à l'acide rapide
• 4 références

Fondation

La base de cette technique de coloration est basée sur les propriétés de la paroi cellulaire de ces microorganismes. La paroi est formée par un type d'acides gras appelés acides mycoliques; Celles-ci sont caractérisées par de très longues chaînes.

Lorsque les acides gras ont des structures très longues, ils peuvent retenir plus facilement les colorants. Certains genres de bactéries sont très difficiles à colorer avec la coloration de Gram, en raison de la teneur élevée en acide mycolique de la paroi cellulaire.

Dans la coloration de Ziehl-Neelsen, le composé phénolique carbol fuchsine, un colorant basique, est utilisé. Ceci a la capacité d'interagir avec les acides gras de la paroi cellulaire, ce qui est à la température ambiante texture cireuse.

La tache de carbol fuchsine est améliorée en présence de chaleur, car la cire fond et les molécules de colorant se déplacent plus rapidement dans la paroi cellulaire.

L'acide utilisé plus tard sert à décolorer les cellules non colorées car leur paroi n'était pas suffisamment liée au colorant; par conséquent, la résistance du décolorant acide est capable d'éliminer le colorant acide. Les cellules qui résistent à cette décoloration sont appelées résistantes aux acides.

Coloration secondaire

Après la décoloration de l'échantillon, ce contraste avec un autre colorant appelé colorant secondaire. Le bleu de méthylène ou le vert malachite sont généralement utilisés.

Le colorant secondaire colore le matériau de fond et crée par conséquent un contraste avec les structures qui ont été teintées lors de la première étape. Seules les cellules blanchies absorbent le second colorant (anti-taches) et prennent leur couleur, tandis que les cellules acido-résistantes conservent la couleur rouge.

Cette procédure est fréquemment utilisée pour l'identification de Mycobacterium tuberculosis et Mycobacterium leprae, appelés bacilles acido-résistants.

Réactifs

Colorant primaire

La carboxine à 0,3% de fuchsine (filtrée) est utilisée. Ce colorant est préparé à partir d'un mélange d'alcools: phénol dans de l'éthanol (90%) ou du méthanol (95%) et dans ce mélange, 3 grammes de fuchsine basique sont dissous.

Solution décolorante

Cette étape peut employer des solutions d'alcool de l'acide 3% d'acide sulfurique ou de 25%.

Coloration secondaire (anti-colorant)

Le colorant le plus utilisé pour le contraste dans les échantillons méthylène généralement bleu 0,3%. Cependant, vous pouvez également en utiliser d'autres, tels que le vert malachite à 0,5%.

Technique

Procédure de coloration à l'acide rapide

Préparer un frottis bactérien

Cette préparation se fait sur une lame propre et sèche, en suivant les précautions de stérilité.

Séchage du frottis

Laisser le frottis sécher à température ambiante.

Chauffer l'échantillon

L'échantillon doit être chauffé en appliquant le feu sur la diapositive ci-dessous. Une fixation avec de l'alcool peut être effectuée lorsque le frottis n'a pas été préparé avec des crachats (traités avec de l'hypochlorite de sodium pour le blanchir) et s'il ne va pas être coloré immédiatement.

M. tuberculosis Il est éliminé avec de l'eau de Javel et pendant le processus de coloration. La thermofixation des crachats non traités ne tue pas M. tuberculosis, alors que la fixation à l'alcool est bactéricide.

Couvrir la tache

La tache est recouverte d'une solution de fuchsine phéniquée (colorant primaire de base).

Chauffer la tache

Ceci est fait pendant 5 minutes. Vous devriez remarquer une libération de vapeur (environ 60 ° C). Il est important de ne pas surchauffer et d'éviter de brûler l'échantillon.

En ce qui concerne le chauffage de l'endroit doit être très prudent pour chauffer la fuchsine phéniquée, surtout si la coloration est réalisée sur un plateau ou un autre récipient dans lequel il a été recueilli des produits chimiques hautement inflammables coloration avant.

Seule une petite flamme doit être appliquée sous la lame à l'aide d'un coton tige sur humidifiée avec quelques gouttes d'alcool acide, méthanol ou éthanol à 70%. Évitez d'utiliser un gros tampon imbibé d'éthanol, car il s'agit d'un risque d'incendie.

Laver la tache

Ce lavage doit être fait avec de l'eau propre. Si l’eau du robinet n’est pas propre, lavez le frottis avec de l’eau filtrée ou distillée, de préférence.

Couvrir le frottis avec de l'alcool acide

Cet alcool acide devrait être à 3%. La couverture est effectuée pendant 5 minutes ou jusqu'à ce que le frottis soit suffisamment décoloré, c'est-à-dire rose pâle.

Il faut tenir compte du fait que l'alcool acide est inflammable; par conséquent, il devrait être utilisé très soigneusement. Évitez d'être à proximité de sources d'inflammation.

Laver la tache

Le lavage doit être effectué avec de l'eau distillée propre.

Couvrez le frottis avec de la teinture

Il peut être un colorant vert malachite (0,5%) ou le bleu de méthylène (0,3%) pendant 1 ou 2 minutes, en utilisant la plus longue si le frottis est mince.

Laver la tache

Encore une fois, de l'eau propre (distillée) doit être utilisée.

Égoutter

Effacer le dos de la lame et de placer la pièce sur un drain de plateau de sorte que ce séchage à l'air (ne pas utiliser du papier absorbant pour le séchage).

Examiner le frottis au microscope

L'objectif 100X et l'huile d'immersion doivent être utilisés. Scannez le frottis systématiquement et notez les observations pertinentes.

Interpréter les résultats

En théorie, les micro-organismes seront colorés une couleur rougeâtre sont considérés comme résistant à l'alcool acide positif (+ AAR).

Inversement, si les micro-organismes sont colorées en bleu ou en vert, en fonction du colorant utilisé comme anti-colorant, sont considérés comme résistant à l'alcool d'acide négative (AAR-).

Références

1. Apurba, S. et Sandhya, B. (2016). Les bases de la microbiologie pratique (1er éd.). Jaypee Brothers Medical Publishers.
2. Bauman, R. (2014). Microbiologie avec maladies par système corporel (4ème éd.). Pearson Education, Inc.
3. Heritage, J., Evans, E. et Killington, A. (1996). Microbiologie d'introduction (1er éd.). Cambridge University Press.
4. Morello, J., Granato, P. Wilson, M. et Morton, V. (2006). Manuel de laboratoire et manuel en microbiologie: applications aux soins des patients (11ème éd.). McGraw-Hill Education.
5. Vasanthakumari, R. (2007). Manuel de microbiologie (1er éd.). B.I. Publications PVT.